Die Vorgänger des Prager Zoologischen Gartens waren unterschiedliche Tiergehege, die bereits zu Kaisers Zeiten entstanden sind. Das bekannteste Tiergehege unter ihnen war vermutlich der Löwenhof (tsch.: Lví dvůr) auf der Prager Burg zu Zeiten Rudolf II, in dem nicht nur Löwen als heraldische Tiere (der Löwe als Symbol der Kraft und des Mutes) gehalten worden sind, sondern auch weitere einzigartige Tiere, wie Orang-Utans oder angeblich die heute ausgerotteten Dodos. Später wurden einigermaßen laienhafte Versuche unternommen, einen Tiergarten an unterschiedlichen Orten anzulegen – in der Stromovka, im Paradiesgarten (tsch.: Rajská zaharda) im Letna-Park und „Na Štvanici”, im Vrchlický Park oder in den Kinsky Gärten – doch alle scheiterten.
Der erste Zoologische Garten auf böhmischem Boden wurde im Jahre 1919 dank eines deutschen naturwissenschaftlichen Vereins in der Stadt Liberec gegründet.
Um den Prager Zoo hat sich auf hoher, fachlicher Ebene Professor Jiří Janda, ein bekannter Zoologe und Ornithologe, Autor eines Werks über Wirbeltiere, insbesondere über Vögel, Lehrer der Naturwissenschaften am Akademischen Gymnasium und Mitglied im Beratungskörper des Unterrichtsministeriums, verdient gemacht. Im Jahre 1921 wurde er mit der Ausarbeitung eines Vorschlags für die Anlegung eines Tiergartens in Prag betreut und nach dessen Entstehung wurde er dessen erster Direktor. Im Jahre 1924 suchte er als Standort Grundstücke im Prager Stadtteil Troja aus, im Jahre 1926 wurde als Investor und Betreiber des Tiergartens die Genossenschaft „Hospodářské, nákupní a stavební družstvo Zoologická zahrada” gegründet. Die Grundstücke schenkte der Großgrundbesitzer Svoboda T. G. Masaryk mit dem Ziel, damit auf ihnen eine Ausbildungseinrichtung für arme, ländliche Jugend entstehe. Diese Schenkung ermöglichte es später, auf einer Fläche von acht Hektar im Stadtteil Troja einen Tiergarten zu errichten. Der Tiergarten wurde der Öffentlichkeit erstmals am 28.9.1931 zugänglich gemacht und hatte zu dieser Zeit etwa über 200 Tiere. Der Tiergarten wurde anfangs nach den Plänen des Projektbüros Hagenbeck errichtet. Bis zum Jahre 1933 wurde ein Administrationsgebäude erbaut sowie ein Pavillon für katzenartige Raubtiere. Den Bau leitete zu dieser Zeit der führende Funktionalismus-Architekt Jiří Fuchs (z. B. Ausstellungs-Palais).
Im Jahre 1932 kamen die ersten Przewalski-Pferde in den Zoo, die zu seinem Symbol wurden und bei deren Züchtung sich der Zoo an die weltweite Spitze setzen konnte. Bis heute werden sie hier mit großem Erfolg gezüchtet, dank Prof. Bílek. Im Jahre 1959 wurde der Prager Zoo mit der Führung eines Zuchtbuchs beauftragt, also mit dem Verzeichnis aller lebenden Przewalski-Pferde, die in freier Natur bereits gänzlich verschwunden sind. Der Prager Zoo hat entscheidend dazu beigetragen, dass dieses zoologische Exemplar nicht ausgestorben ist.
In den darauffolgenden Jahren nach Eröffnung des Tiergartens kamen der erste Gepard, ein indischer Elefant, ein Flusspferd sowie ein Spitzmaulnashorn. Im Jahre 1936 wurde der Raubtier-Pavillon fertig gebaut, im Jahre 1937 wurde ein Kondor groß gezogen und im Jahre 1940 gelang es zum ersten Mal weltweit, einen Eisbären groß zu ziehen. Im Jahre 1954 ging der Tiergarten aus den Händen der Genossenschaft in die Obhut des Staates über. In den Jahre 1947 – 49 entstanden neue Pavillons für Affen und wertvolle Säugetiere, 1956 kam ein Pavillon für Wasservögel hinzu. Im Jahre 1950 gab es in Prag den ersten Schimpansen, 1961 den ersten Orang-Utan und 1963 den ersten Gorilla. Im Jahre 1969 gelang die erste Aufzucht eines Nebelparders in der Tschechoslowakei, 1972 die erste Aufzucht eines Gepards. Gleichzeitig wurden der neuen Pavillons für die Elefanten, Nilpferde und Nashörner eröffnet. Im Jahre 1981 kamen Nashorn-Zwillinge auf die Welt. Zu den wertvollsten Ergebnisse gehören zum Beispiel die Aufzucht des Neuguinea-Dingos und vornehmlich des kubanischen Leguans, dessen Fortpflanzung dem Prager Zoo als einzigem weltweit in der gemäßigten Zone regelmäßig gelingt. Beachtenswert ist auch die Aufzucht der zahlreichen Pelikane und Flamingos, die Aufzucht des Roten Pandas, von Antilopen, des Mähnenwolfs und vieler anderer.
Eine gänzlich neue Art der letzten Jahre sind die zarten Springtamarine (Callimico goeldii) aus der Familie der Krallenaffen, die Goldenen Löwenäffchen (Leontopithecus rosalia) und die Südlichen Pudus (Pudu Puda). Auf Grund des großen Zuchterfolgs der riesigen Galapagos-Schildkröten, die in europäischen Tiergärten nur sehr vereinzelt gehalten werden, konzentrieren westeuropäische Zoos diese Haltung eben in Prag. Im Jahre 1995 begann der Bau eines Schildkröten-Pavillons mit einer Größe von 18 x 24 Metern neben der Talstation der Seilbahn. Eröffnet wurde er feierlich im Jahre 1998. Ein Teil der Fläche imitiert für die Riesenschildkröten die Natur auf den Galapagosinseln, ein Teil die Natur auf den Seychellen für die Pinta-Reisenschildkröten (Geochelone nigra). Außerdem gibt es ein großes Terrarium für Neu-Guinea Warane.
Der Enkel des Großgrundbesitzer Svoboda, der die Grundstücke im Prager Stadtteil Troja einst gestiftet hatte, Quido Schwank schenkte der Stadt im Jahre 1997 Geld für die Tiergarten-Erneuerung sowie für zwei Büsten der Mäzene. Von diesem Geld wurden barrierefreie Zugänge in den Tierpark errichtet. Im September 2001 konnten zwei weitere große Gebäude eröffnet werden – das Afrika-Haus und der Gorilla-Pavillon. Das Afrika-Haus erinnert an ein Eingeborenen-Dorf und an die Savanne. Es gibt hier Ställe für elf Rothschild-Giraffen, die zu den meist bedrohten Arten in der Natur zählen, für Pinselohrschweine oder Flussschweine (Potamochoerus porcus Linnaeus), Erdferkel (Orycteropus afer), Webervögel (Ploceidae) und Heuschrecken. Im Gorilla-Pavillon haben fünf hoch bedrohte Gorillas Platz, ebenso wie eine Gruppe von Springtamarinen, Krallenaffen, die zu den kleinsten Primaten weltweit zählen. Neu ist auch eine Ausstellung großer Papageien, die unter freiem Himmel bewundert werden können. Ihre Schwungfedern sind aber gestutzt, damit sie nicht wegfliegen.
Das Hochwasser im Jahre 2002 beschädigte den Prager Zoo sehr. Das Jahrhunderthochwasser überschwemmte den gesamten unteren Bereich des Tiergartens, innerhalb weniger Stunden wurden über 1.000 Tiere evakuiert, davon 750 Vögel, 150 Kriechtiere und über 100 Säugetiere. Das Wasser verursachte immense Schäden, leider auch bei den Tieren. Viele ertranken oder mussten eingeschläfert werden – 80 Vögel, 9 Säugetiere, inklusive eines Elefanten, 2 Nilpferde, 1 Gorilla, 1 Löwe, 1 Bär, 1 Seebär und zwei Nilpferde. Der Schaden am Besitz wurde mit 125 Millionen tschechischen Kronen beziffert.
Am 21. Februar 2004 wurde der Pavillon „Afrika aus nächster Nähe“ (tsch.: Afrika zblízka) feierlich eröffnet. Er wurde im Jahre 1951 als Pavillon für wertvolle Säugetiere erbaut. Über fünfzig Jahre war er ohne Veränderungen in Betrieb. Im Jahre 2003 bedrohte sein katastrophaler Zustand aber geradezu die Gesundheit der Tiere und aus hygienischen, technischen als auch sicherheitstechnischen Gründen drohte die Gefahr, das Objekt für längere Zeit schließen zu müssen. Aus diesem Grunde entschloss sich der Zoologische Garten für die schnellstmögliche Rekonstruktion. Dank der Rekonstruktion erhielt der Pavillon einen neuen inhaltlichen als auch züchterischen Inhalt. Nun ist er auf kleine Lebewesen des afrikanischen Kontinents spezialisiert. Die Auswahl der Säugetiere, Kriechtiere oder wirbellosen Tiere konzentriert sich auf jene Arten, die nachtaktiv sind, unter der Erde oder unter Steinen leben und die in entlegenen Orten der Wüste oder hoch in den Baumkronen zu finden sind. Insgesamt werden in diesem Pavillon beinahe sechzig Arten vorgestellt. Bestandteil des Pavillons sind auch seine Außenbereiche, die vom selben Geist erfasst sind – als authentisches Menhir-Feld irgendwo in einem afrikanischen halbwüstenartigen Biotop. Im Gegensatz zum imitierten Innenraum sind alle Materialien, die im Außenbereich verwendet worden sind, echt.
Schrittweise wurden die neuen, rekonstruierten Pavillons in Betrieb genommen – ab 23.10.2003 der Gorilla-Pavillon, ab 4.4.2004 der Pavillon Szechuan, ab 13.6.2004 der Pinguin-Pavillon. Vom im Jahre 2002 zerstörten Pinguin-Pavillon waren nur die Außenwände stehen geblieben. In den darauffolgenden Jahren entstand hier ein neues Schwimmbecken, wo Besucher die Pinguine auch unter Wasser beobachten können. Eine Neuigkeit ist die Internet-Kamera, die es 24 Stunden pro Tag während einer Live-Übertragung ermöglicht, die Pinguine des Prager Zoos im Internet live zu beobachten.
Am 15.8.2004 wurde nach zweijähriger Rekonstruktion der Raubtier-Pavillon eröffnet.
Gegenwärtig umfasst der Prager Zoo über 60 Hektar außergewöhnlich passender Grundstücke, die drei Arten an natürlicher Umgebung entsprechen: ein Teil ist eine steile Felsenwand, die sich nach Süden neigt, unter ihr befindet sich eine geschützte Tal-Ebene und ober ihr eine kühle und windige Hochebene, die teilweise von Wald durchwachsen ist.